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为什么C18是反相色谱法中广受欢迎的固定相?

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客座作者:资深科学家Seyed Sadjadi

我们将要探讨为何C18是反相色谱法中非常常用的固定相及其原理

或许将C18称为选择丰富的固定相更加确切。这种固定相的种类不断增加,因此色谱柱供应商显然不会在这方面出现缺货的情况。但是,在我们深入探讨这一话题之前,我们先来简单回顾一下C18固定相的由来。

起初,一位名叫Mikhail Tsvet的俄国植物学家试图分离植物组织中的天然色素(类胡萝卜素、叶绿素等)。有人可能已经猜到,Tsvet用于分离试验的材料并不是键合了C18配体的有着完美球形和均匀尺寸的全多孔硅胶颗粒,并紧密填充到不锈钢管当中!他使用大自然提供给他的材料,将矿物和岩盐(钙盐)作为固定相,把乙醇混合物作为流动相。Tsvett将这种分离技术成为“色谱法”,如今它已成为分析化学领域的重要分支之一。

反相色谱法

在早期的色谱实验中(Tsvet设计的试验),疏水性化合物首先从色谱柱中洗脱,然后是极性化合物。这一洗脱顺序被称为正相色谱法(NP)。几十年后,随着越来越多的科学家涉足这一领域,其它一些新的分离模式也随之诞生并用于分离和纯化众多不同基质的各种类别的化合物。虽然我很想一一介绍这些新的方法,但今天我们的重点是反相色谱法(RP)。

对于这种分离模式,离子和强极性分析物会先从色谱柱中洗脱,然后是更具疏水性的分析物。此时,化合物的洗脱顺序与 Tsvet的试验中的相反。因此,这一模式被成为“反相”色谱法。

反相色谱法技术的最终目的是将具备不同疏水性的分析物分离。简单地说,这项工作可以通过以下两个步骤完成:

  • 使用一个疏水性固定相来保留分析物。

  • 通过对一个有强弱差异的多组分流动相体系进行优化,使其成为目标分析物的理想洗脱溶剂。这里面可同时包含有机溶剂和缓冲液。并非所有化合物都具有强酸性或强碱性,但它们可能都带有极性基团,因此需要较窄的pH范围来控制它们的电离状态。

1.疏水固定相

烃类是疏水性化合物的极好范例,实际上它们属于油性物质。具体而言,直链烷烃很适合作为固定相使用。我们应当注意的是,随着化学链中的碳原子数量的增加,烃类的物理性质也会发生改变—C1到C4为气态;C5-C17为液态;C18及以上为固态。除了烷烃外,诸如芳香烃和环烷烃也可作为固定相使用。这些固定相将在其它文章中讨论。C18之所以那么受欢迎,原因之一可能是因为用于键合反应的原材料在当时就易于获得。这一幸运的巧合使人们进一步发现C18原来如此适合用于色谱分析。总之,这两个因素都让C18成为了反相色谱法固定相的中流砥柱。

下一步就是将烷烃基团(即C18或十八烷基)键合到合适的基质。硅胶是理想的填料,硅胶颗粒有诸多形态(球形或不定形)、粒径(0.9 至10 µm或更大)、孔径(最大可到1000 Ȧ),而且可以有全多孔和实心核两种形态。

在键合过程完成之后(该过程的许多细节都保密),C18配体在分子层级上被连接至硅胶,在硅胶颗粒孔道中的一般分布状态,如下图所示。

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图 1. C18配体键合在硅胶上

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图 2. 硅胶孔表面上的两个C18配体分子的一般分布

2.RPC保留机制

C18固定相的美妙和简洁之处在于它能够带来非常简单的疏水作用。流动相中的溶质在硅胶孔道中移动的过程,它们会因为较弱的疏水(以及范德华力)作用而被C18碳链吸引和保留。图3 给出了该相互作用的示例。

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图 3, C18配体和化合物之间简单的疏水作用

图4 显示C18配体与化合物的苯环结构及其丙基部分之间有疏水作用。而由于氮上有正电荷,所以C18配体与分子另一侧的氨基之间的吸引力被降到了最低。

用于指示化合物疏水程度的参数被称为log P。该参数与化合物在正辛醇和水中的分配系数的比值有关。log P值为正则说明目标化合物在正辛醇中的溶解度更高,因此疏水性更强。log P值为负则说明目标化合物在水中的溶解度更高,因此亲水性更强。图4给出了各类化合物的logP范围。

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图 4.各类化合物的log P范围

在了解这一概念后,如何开展工作就很明确了:要想在 C18色谱柱上保留化合物,那么化合物就必须尽可能为中性或有很高的疏水性。显然,如果分析物已经是中性或不可能带有电荷的话,那么我们无法对其进行任何操作。但是,如果是弱酸性或弱碱性化合物,我们就可以使用缓冲液来控制它们的带电程度。另一个需要在这里用到的化学概念是pKa(和 pKb)。 溶液中的弱酸和弱碱以两种形态存在:一种是它们的中性形态,另一种是它们的去质子化形态(酸)或质子化形态(碱)。在特定的pH值下,这两种共轭形态在溶液中的浓度相同。这时的pH值等于该化合物的 pKa和pKb。下面的图中(图5)给出了这两个pK值以及化合物的疏水性增减和溶液pH变化之间的函数关系。

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图5. 图中显示了弱酸和弱碱共轭物与溶液pH之间的函数关系

在一般实践中,建议将流动相的 pH值调至在分别高于pKb或低于pKa两个单位,从而确保化合物所处的形态能使其尽可能在反相模式被保留。当然,任何事情和任何规律都可能有例外的情况。

到目前为止,我们只介绍了流动相的一个组分,也就是水相部分。我们知道需要利用一些化学性质来提高分析物在C18固定相上的保留。现在,我们要讨论的自然就是如何从C18固定相洗脱分析物。

为了克服反相条件下的疏水作用,我们常用的是甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)和四氢呋喃(THF)这三种溶剂。从强度上来看,MeOH最弱,而THF最强。这里说的强度是指使用每种溶剂后分析物洗脱的速度。当流动相比例固定,对于单个分析物来说,使用THF相比使用其它两种溶剂而言洗脱速度要快得多。但是,如果有多种分析物,那么溶剂强度高并不代表选择性也会成比例地提高。在以后的文章中,我们会介绍反相色谱法中溶剂选择性的差别。

总之,C18是反相色谱法中使用的简单又方便的固定相。

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