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复方氨基酸注射液中氨基酸分析报告

应用简介

本实验采用异硫氰酸苯酯(PITC)为衍生剂,并在衍生过程中加入二巯基二丙酸(MPA)保护半胱氨酸。同时采用反向高效液相色谱法,以正亮氨酸为内标物,使用Venusil○RAA氨基酸分析方法包,分析复方氨基酸注射液样品中氨基酸组成。本方法快速、灵敏、准确,特别适用于同时含有胱氨酸和半胱氨酸的多肽氨基酸组成的测定。

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前言

氨基酸是生物体中重要的生命物质,是组成酶和蛋白质的基本单元。作为小分子,氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用;作为配体,它可与多种金属离子配位,为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能,因此,准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。

本实验采用Venusil AA氨基酸分析方法包中的检测标准,使用Venusil AA氨基酸分析专用柱对复方氨基酸注射液中的氨基酸组成进行了测试。

实验部分

仪器、试剂与材料

试剂材料

流动相A:称取15.2 g无水醋酸钠,加水1850 mL溶解,用冰醋酸调节pH至6.5,然后加入乙腈140 mL,混匀;

流动相B:乙腈︰水=80︰20;

稀盐酸:0.1 mol/L盐酸;

二疏基二丙酸(MPA)溶液:取MPA约8.0 mg,加入200 mol/LNaOH溶液1mL溶解;

内标溶液:称取正亮氨酸10 mg,置于10 mL容量瓶中,加稀盐酸溶解并定容至刻度;

色氨酸:称取色氨酸10 mg,置于10 mL容量瓶中,加稀盐酸溶解并定容至刻度;

三乙胺乙腈溶液:取VenusilRAA氨基酸分析方法包中三乙胺一瓶,加乙腈8.6 mL,混匀;

异硫氰酸苯酯乙腈溶液:取VenusilRAA氨基酸分析方法包中异硫氰酸苯酯溶液1瓶,加乙腈2.0 mL,混匀;

氨基酸标准溶液:取VenusilRAA氨基酸分析方法包中17种氨基酸标准溶液(包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、赖氨酸)1.0 mL,加色氨酸溶液0.5 mL,稀盐酸3.5 mL稀释,混匀;

复方氨基酸注射液样品:无色透明液体,由某医药科技公司提供。

样品制备

移取复方氨基酸注射液样品1.0 mL,置于50 mL离心管中,加入稀盐酸30 mL,混匀,作为样品溶液,待衍生使用。

氨基酸标准溶液和样品溶液的衍生

取18种氨基酸标准溶液(含色氨酸2.5 μmol/mL)、上述复方氨基酸样品溶液各200 μL,分别置于1.5 mL离心管中,向每个离心管中加入MPA溶液 40 μL,再向每个离心管中加入内标溶液20 μL,混匀,然后依次向每个离心管中加入三乙胺乙腈溶液100 μL,异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL,混匀,室温放置1小时。再向每个离心管中加入400 μL正己烷,振摇后放置10 min,取下层溶液200 μL,加800 μL水稀释,经0.45 μm针筒过滤器过滤,取续滤液作为样品试液。

色谱条件

色谱柱:Venusil AA;5 μm;4.6 × 250 mm;

流  速:1.0 mL/min;

柱  温:40 ℃;

波  长:254 nm;

进样量:10 μL;

梯  度:

表1.液相色谱梯度洗脱条件

时间/min

A/%

B/%

0

100

0

2

100

0

15

90

10

25

70

30

33

55

45

33.1

0

100

38

0

100

38.1

100

0

45

100

0

结果与讨论

本实验采用VenusilRAA氨基酸分析方法包对复方氨基酸注射液中氨基酸进行了测试,由表2及图2可知,使用VenusilRAA氨基酸分析方法包共检测出复方氨基酸注射液中17种氨基酸,各氨基酸峰间的分离效果较好。

表2. 复方氨基酸注射液中氨基酸测试结果

色谱峰序号

对照溶液

样品溶液

保留时间/min

氨基酸名称

保留时间/min

氨基酸名称

1

4.494

门冬氨酸

4.457

门冬氨酸

2

5.244

谷氨酸

3

10.766

丝氨酸

10.716

丝氨酸

4

11.628

甘氨酸

11.531

甘氨酸

5

12.096

组氨酸

12.043

组氨酸

6

13.339

胱氨酸

13.277

胱氨酸

7

13.743

精氨酸

13.702

精氨酸

8

14.940

苏氨酸

14.883

苏氨酸

9

15.662

丙氨酸

15.599

丙氨酸

10

16.396

脯氨酸

16.356

脯氨酸

11

22.940

酪氨酸

22.956

酪氨酸

12

24.304

缬氨酸

24.310

缬氨酸

13

25.277

蛋氨酸

25.282

蛋氨酸

14

27.334

异亮氨酸

27.334

异亮氨酸

15

27.642

亮氨酸

27.635

亮氨酸

16

28.258

正亮氨酸

28.262

正亮氨酸

17

29.154

苯丙氨酸

29.162

苯丙氨酸

18

29.610

色氨酸

29.647

色氨酸

19

30.850

赖氨酸

30.861

赖氨酸

图1. 19种混合氨基酸对照溶液高效液相色谱图

图2. 复方氨基酸注射液供试品溶液高效液相色谱图

结论

根据实验结果,使用VenusilRAA氨基酸分析方法包共检测出复方氨基酸注射液中17种氨基酸,各氨基酸峰间的分离效果较好,能够满足检测要求。

附:相关产品

产品名称

规格描述

包装数量

订货号

VenusilRAA氨基酸分析方法包

1

AA952505-K

VenusilRAA氨基酸分析专用柱

4.6 × 250mm,5 μm

1

AA952505-0

异硫氰酸苯酯(PITC)

25 μL

10

AA-D

氨基酸标准溶液(含17种氨基酸)

1 mL

2

AA-S

正亮氨酸(Nle)

100 mg

1

AA-I

三乙胺(TEA)

1.4 mL

2

AA-B

色氨酸(Trp),单独订购

100 mg

1

AA-T

1.5 mL样品瓶

短螺纹透明带书写处32 × 11.6 mm

100/PK

1109-0519

1.5 mL样品瓶盖

9 mm中心孔蓝盖,红色橡胶/米色PTFE隔垫45°Shore A;1.0 mm

100/PK

0915-1819

微孔滤膜

单膜,13 mm,0.45   μm

100个/包

AS021345-T

一次性注射器

2 mL无针头

100支/包

LZSQ-2ML

应用编号:AP10037

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