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(GB/T 19857-2005) 鱼肉中孔雀石绿和结晶紫的测定

应用简介

本实验重现了GB/T 19857-2005中的前处理方法,采用Cleanert® Alumina-N小柱结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)对鱼肉中孔雀石绿和结晶紫进行了测定。样品经乙腈提取,Cleanert® Alumina-N小柱净化,LC-MS/MS进行检测,以0.1%甲酸水和乙腈为流动相进行梯度洗脱,内标法定量。结果表明,当加标量为2.5 µg/kg时,回收率在90% ~ 115%之间,能够满足检测要求。

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前言

孔雀石绿是人工合成的有机化合物。其生产是由1摩尔分子的苯甲醛(Benzaldehyde)和2摩尔分子的二甲苯胺在浓盐酸混合下,加热缩合成隐色素碱(Leuco base),在酸性条件下加过氧化铅使其氧化,并在碱性液中沉淀出色素碱。它属于三苯甲烷型的绿色染料。孔雀石绿是有毒的三苯甲烷类化学物,既是染料,也是杀真菌、杀细菌、杀寄生虫的药物,长期超量使用可致癌,无公害水产养殖领域国家明令禁止添加。

本文通过对国标方法的重现,建立了鱼肉中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫同时测定的分析方法。

实验部分

仪器、试剂与材料

主要仪器设备

AB SCEIX API 4000+液相色谱串联质谱仪。

试剂材料

乙腈为色谱纯;实验用水为超纯水;乙酸铵为分析纯;

孔雀石绿、结晶紫混合标准工作溶液:孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫,乙腈溶解;

内标标准溶液:氘代孔雀石绿、氘代隐色孔雀石绿,2 ng/mL,乙腈︰5 mmol/L乙酸铵溶液=1︰1(V/V)溶解;

Cleanert® Alumina N固相萃取小柱:1000 mg/3 mL。

样品制备

样品提取

称取均质好的鱼肉样品5 g置于50 mL离心管中,加入200 µL 2 ng/mL的内标标准溶液,再加入11 mL乙腈,超声提取2 min,8000 r/min匀浆30 s,4000 r/min离心5 min,取全部上清液置于25 mL比色管中,取另一离心管加入11 mL乙腈洗涤匀浆刀头10 s,合并于装有样品残渣的离心管中,残渣用玻璃棒捣碎,涡旋30 s,超声振荡5 min,4000 r/min离心5 min,合并两次上清液,用乙腈定容至25 mL,摇匀,待净化。

样品净化

将Cleanert® Alumina-N小柱用5 mL乙腈活化,从上述待净化液中取出5 mL上样于小柱上,收集流出液于KD浓缩瓶中,再用4 mL乙腈洗涤小柱,收集流出液于同一KD浓缩瓶中,将流出液于45℃旋蒸至小于1 mL,用乙腈定容至1 mL,超声振荡5 min,加入1 mL 5 mmol/L乙酸铵溶液,超声振荡1 min,经0.22 µm尼龙针式过滤器过滤,待检测。

以上操作可用卓睿全自动固相萃取仪完成。

实验条件

色谱条件

色谱柱:Venusil MP C18,3 µm,100 Å,3.0 × 50 mm

流动相:A相-0.1%甲酸水溶液(V/V),B相-乙腈

柱  温:30℃

进样量:5 µL

梯度洗脱条件(见表1)

表1. 液相色谱梯度洗脱条件

时间(min)

流速(mL/min)

A%

B%

0.0

0.3

60

40

1.0

0.3

60

40

2.0

0.3

10

90

6.0

0.3

10

90

6.1

0.3

60

40

10.0

0.3

60

40

质谱条件

离子源:ESI+;电喷雾电压:5500 V;雾化气压力:50 psi;气帘气压力:25 psi;辅助气压力:50 psi;离子源温度:500℃;采集方式:多反应监测(MRM)。

表2. 孔雀石绿质谱参数

物质名称

Q1

Q3

DP/V

CE/V

孔雀石绿

329.1

313.2

95.1

49.7

208.2

95.1

46.9

隐色孔雀石绿

331.1

239.3

105.1

42.0

316.3

105.1

30.5

结晶紫

372.4

251.4

112.1

53.4

358.4

112.1

47.3

隐色结晶紫

374.2

239.2

114.8

40.2

318.2

114.8

49.1

D5-孔雀石绿

334.0

318.2

97.0

53.1

213.3

97.0

48.9

D6-隐色孔雀石绿

337.4

240.2

107.4

40.8

322.4

107.4

31.5

注:“下划线”为定量离子。

结果与讨论

由表3可知,使用Cleanert® Alumina-N固相萃取小柱处理鱼肉基质,并结合LC-MS/MS检测鱼肉中的孔雀石绿与结晶紫,加标回收率在90% ~ 115%之间,且变异系数小于10%,能够满足检测要求。由图1可知,用Venusil MP C18色谱柱分离孔雀石绿与结晶紫,分离效果良好。

表3. 鱼肉中孔雀石绿与结晶紫加标回收实验结果(添加水平2.5 µg/kg)

物质名称

保留时间/min

平均回收率/%

CV/%

孔雀石绿

1.65

90.3

4.4

隐色孔雀石绿

4.17

98.1

1.8

结晶紫

3.87

113.7

2.7

隐色结晶紫

1.46

97.0

1.5

 

图1. 0.01 µg/mL 孔雀石绿结晶紫混合标准溶液色谱图

结论

本实验建立了鱼肉中孔雀石绿与结晶紫的前处理方法,并结合LC-MS/MS对样品进行了检测。结果表明,对于加标量为2.5 µg/kg的鱼肉样品,加标回收率在90% ~ 115%之间,且变异系数小于10%,满足检测要求。说明该方法适用于鱼肉中孔雀石绿与结晶紫的检测。

附:相关产品

产品名称

规格描述

包装数量

订货号

Cleanert®   Alumina-N

1000 mg/3 mL

30支/包

AL0003-N

卓睿全自动固相萃取仪

4通道,24位

1台

SPE-40

Venusil MP C18

3   µm,100 Å,3.0   × 50 mm

1支

VA930503-0

1.5 mL样品瓶

短螺纹透明带书写处

32   × 11.6 mm

100/pk

1109-0519

氮吹仪

15位

1台

NV15-G

1.5   mL样品瓶盖

9   mm中心孔蓝盖,红色橡胶/米色PTFE隔垫

45°Shore   A; 1.0 mm

100/pk

0915-1819

尼龙针式过滤器

单膜,13   mm,0.22 µm

200个/包

AS021320

一次性注射器

2   mL无针头

100支/包

LZSQ-2ML

 应用编号:AF10146


  • Cleanert Alumina N

    Cleanert Alumina N 中性氧化铝萃取柱pH=7.5;强极性吸附剂。表面呈中性,容易保留杂环类(含氮,磷,硫基),芳香烃和有机胺等富电子化合物。经过特殊去活处理,以保证样品的前处理。

  • Qdaura 卓睿全自动固相萃取仪

    Qdaura 卓睿全自动固相萃取仪是针对食品、农产品、医药等行业污染物分析而设计的样品前处理设备,可以实现从活化、上样、淋洗至洗脱整个固相萃取过程的全自动化。4 萃取通道,连续处理24 个样品,通过独特的设计,实现小体积上样的同时,兼顾大体积样品中有机物、重金属、农药残留等痕量污染物的富集。

  • Venusil MP C18

    Venusil MP C18 是一款通用型制备柱,适用于分离 极性和非极性化合物。

  • ND9(广口)

    广口短螺纹样品瓶 适配:Agilent Thermo Scientific Varian Waters etc.

  • NV24A-II 全自动浓缩氮吹仪

    NV24A-II 全自动浓缩氮吹仪具有处理量大、环保、自动化程度高等优点,应用于各种类型的自动化工作站,遍及环保、供水、药检、食品检验、法医鉴定等领域,适用于较高端样品前处理的实验室要求。

  • 尼龙(Nylon通用)

    广泛的化学相容性(避强酸),良好的柔韧性 ,与大多数试剂相容,低蛋白吸附。 应用于电子、微电子、半导体工业水过滤;药液、饮料、高纯化学品的过滤

  • HPLC 过滤专用一次性注射器

    专业医用注射器厂家生产;节约成本;无需按医疗废弃物处理。

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技术方案 2016年07月12日
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